Валерий Чолаков
Нобеловите награди (54) (Учени и открития (1901–1982))

Клетъчната машина

През 50-те години се установи, че живата клетка е една великолепна машина с изключително сложна структура, в която протичат едновременно хиляди реакции на разграждане и синтез, на разрушение и съзидание, благодарение на които се поддържат структурите на живота. Особени приноси в тези изследвания имат Джордж Палад от Рокфелеровия университет в Ню Йорк, Кристиан де Дюв от същия университет и Албер Клод от Брюкселския университет. Общото за тяхната работа е предпочитанието към метода на диференциалното центрофугиране.

Ултрацентрофугата бе създадена от Те Сведберг за изследвания в колоидната химия. Клетъчните хомогенати, с които работят биохимиците, са също колоидни разтвори и веднага редица учени се заеха да използват новата техника в биологията. Дълго време обаче не можеха да се получат задоволителни резултати. Диференциалното центрофугиране бе създадено след продължителна работа на голям брой учени, сред които водеща роля имаше Албер Клод.

Същността на метода е проста. Клетъчният хомогенат, който е смесица от различните компоненти на клетката, се подлага на последователно центрофугиране с все по-голям брой обороти. Това води до нарастване на ускорението и на изкуствената гравитация, която утаява все по-леки частици от колоидния разтвор. Това ускорение, което характеризира теглото на частицата, се обозначава с единицата „сведберг“ и се бележи с главната латинска буква S. Отначало се утаяват неразрушените клетки. Течността се прелива в друг съд и се продължава по-нататък по същия начин. После се утаяват големите клетъчни фрагменти, ядрата, митохондриите, лизозомите и рибозомите. На всеки етап Албер Клод провеждаше микроскопско наблюдение за идентификация на обектите. Неговите изследвания потвърдиха, че с митохондриите са свързани процесите на окисление. Той проведе биохимични експерименти и откри някои от ензимите на дихателните вериги в състава на митохондриите.

По-нататъшното развитие на диференциалното центрофугиране е свързано с дейността на Кристиан де Дюв. Кулминацията на неговата работа бе откриването на лизозомите през 1963 г. Това откритие бе направено до известна степен случайно. Де Дюв и неговите сътрудници изследваха субклетъчните фракции от чернодробни клетки на плъх. Неочаквано бе открито рязко нарастване на ензимната активност в хомогената. Изследването на този феномен показа, че в клетките има особени частици, в които се съдържат разграждащи ензими. Те са отделени с мембрана от останалата част на клетката. Разкъсването на лизозомата довежда до лизис — разрушение на клетъчните структури или на самата клетка. Така в живите системи се разрушава старото, за да се отвори място на новото. Оказа се, че лизозоми има практически във всички клетки и че те вземат най-дейно участие във физиологичните и патологичните процеси в клетката. Възникна цял раздел на клетъчната патология, който се занимава с дефектите в структурата и функцията на лизозомите.

Отделянето на фракции, състоящи се от все по-дребни частици, наложи използването на електронна микроскопия. С тези средства големи успехи постигна Джордж Палад. Той подробно изучи митохондриите и рибозомите. С електронен микроскоп Палад описа ултраструктурата на митохондриите и по-специално гребенчетата по вътрешната мембрана, наречени на неговото име. Дълги години и рибозомите, изследвани подробно от него, също се наричаха гранули на Палад. Той използваше ултрацентрофугата за изолиране на субклетъчните частици и след това ги търсеше в структурата на самата клетка, за да ги види в първоначалния им вид и да установи техните взаимодействия с другите клетъчни органели.

Албер Клод направи големите си открития още в 40-те години. Палад и де Дюв бяха най-активни през 50-те години. В 1974 г., с известно закъснение, тримата бяха удостоени с Нобеловата награда по медицина и физиология. Тази оценка на Нобеловия комитет при Каролинския институт бе продиктувана от голямата важност на изследванията върху самите клетки, които сега заменят класическия биохимичен експеримент с хомогенни разтвори. Това е част от постепенното обединяване на биохимията с цитологията на нивото на молекулярната биология, когато химичен състав и биологична структура означават вече едно и също. Именно в този аспект е бъдещото развитие на науката за живота.

В историята на физиологията отчетливо се проследява развитието от изследвания на цели животни към тъкани и тъканни екстракти. Това даде възможност да се разкрият детайли в метаболизма, но, от друга страна, доведе до загубване на връзката между структура и функция. Едва през 50-те и 60-те години, с развитие на модерните методи за изследване, физиологията на клетката започна да се свързва с нейните различни органели. Особено големи успехи бяха постигнати в изучаването на синтезата на белтъчините, която се извършва в рибозомите по командата на ДНК с помощта на различни видове РНК. Предстои да се реши къде точно възникват и другите групи химични вещества в клетката. Засега успехите са по-големи в изучаването на начина, по който те се синтезират.

Докато разграждането на въглехидратите бе разкрито сравнително рано, процесът на тяхното синтезиране дълго време оставаше неизвестен. Мнозина големи учени допуснаха, че реакциите са обратими и захарите се изграждат така, както се разграждат. Едва в 1949 г. аржентинският учен Луис Лелоар, ученик на Бернардо Усай, направи едно откритие, което насочи мислите на биохимиците в друго направление. Той установи, че превръщането на монозахаридите от един вид в друг се извършва в присъствието на някакво неидентифицирано вещество. Лелоар го изолира и определи неговата химична природа. То се оказа захарен фрагмент, свързан с нуклеотид. Изследванията на аржентинския учен показаха, че трансформацията на монозахаридите се извършва след свързването им с нуклеотид. Това ги активира и прави реакцията възможна. По-нататък стана ясно, че с помощта на нуклеотиди се осъществява биосинтез на полизахариди като гликоген, нишесте, целулоза и т.н.

Тази идея имаше голямо значение за биохимията. Учените се отказаха от схващането за обратимите реакции. Установи се, че разграждането и синтезата следват различни пътища. Тази мисъл бе потвърдена впоследствие и за други групи съединения и по-специално за белтъчините и нуклеиновите киселини.

Луис Лелоар специализира през 1936 г. биохимия при Хопкинс в Кембридж. В 1944 г. беше асистент на Карл Кори, а след това на Бернардо Усай в Буенос Айрес. Усвоявайки опита на тези големи учени, той успя да направи голям собствен принос в биохимията и това му донесе Нобеловата награда по химия за 1970 г.

Голям дял в учението за метаболизма заема изследването на мастните киселини и другите съединения, които образуват голямата група на липидите. Особен интерес представляват стеролите, към които спадат голям брой физиологично активни съединения. Химичната структура на тези съединения започна да се изяснява в началото на века и в 1928 г. Виндаус и Виланд получиха Нобелова награда по химия за изследвания върху структурата на холестерола и жлъчните киселини. Установи се, че има голям брой стероли в животните и растенията като витамин D, полови хормони и хормони на надбъбречната жлеза и др. Някои от тях са известни доста отдавна. Самият холестерол бе открит преди 200 години и неговото име означава „жлъчен камък“. Подробности за механизма на тяхното синтезиране обаче започнаха да се разкриват едва след като Конрад Блох и Феодор Линен приложиха метода на белязаните атоми за изучаване на веригите от биохимични реакции.

Изследванията на тези учени положиха основите на съвременните знания за динамиката на процесите в живите клетки. Едно фундаментално откритие, направено в лабораторията на Шьонхаймер в Колумбийския университет, бе изясняването на ролята на оцетната киселина като градивен елемент при синтезата на холестерина и мастните киселини. Тези открития до голяма степен бяха дело на Блох. По същото време Линен, в Мюнхенската лаборатория на Хайнрих Виланд — неговия тъст, също изучаваше метаболизма на оцетната киселина и откри едно нейно активирано състояние, което се оказа предшественик на всички липиди в тялото. Този активиран ацетат се получава при редица метаболитни процеси.

Изотопната техника на Блох и неговите сътрудници даде възможност да се разбере как от двувъглеродната ацетатна група се получават дълги молекули с 30 въглеродни атома. Установи се последователност от родствени съединения, които са близки в химично отношение, но във физиологичен аспект стоят доста далеч. Оказа се, че те имат общ произход и просто са етапи от веригата на биосинтезите. Например ланостеролът се изолира от вълната на овцете, а родственият му холестерол е широко разпространен в кръвта и тъканите. От своя страна самият холестерол е предшественик на жлъчните киселини и някои полови хормони.

Линен, който през цялото време работеше успоредно върху същите проблеми, постигна същите резултати. Наред с това обаче той се интересуваше и от клетъчния аспект на проблема, свързвайки го по-тясно с клетъчния метаболизъм и структура. Наред с това Линен показа как веригата от синтези може да се видоизмени, като вместо стероли се получават терпени, каучук и други вещества. В тези реакции участвуват и активирани изопренови молекули.

Биохимичните изследвания на Конрад Блох и Феодор Линен допринесоха много за изучаването на начина, по който се синтезират в организма една група съединения с голямо биологично значение. Холестеролът отдавна интересува медиците, тъй като неговото отлагане по вътрешните стени на кръвоносните съдове води до тяхното стесняване и запушване. Един все още нерешен проблем е как да бъдат отстранявани тези налепи и да се поддържа в ред кръвоносната система. За големи приноси в развитието на науката Конрад Блох и Феодор Линен станаха Нобелови лауреати по медицина и физиология за 1964 г. Те получиха наградата за открития, свързани с механизмите на метаболизма и регулацията на холестерола и мастните киселини.

От средата на миналия век възникна и се развива химията на клетката. Едно от първите нейни постижения е откриването на нуклеиновите киселини. Както показва самото им име, те са свързани с клетъчното ядро. Тези съединения бяха открити от Мишер в 1869 г. Той самият използваше термина нуклеин и едва 20 години по-късно немският биохимик Р. Алтман въведе понятието нуклеинова киселина.

Откритията на Мишер бяха направени в лабораторията на известния биохимик Ф. Хопе-Зайлер. В 1879 г. там започна изследвания над нуклеиновите киселини Албрехт Косел. На нуклеиновите киселини и на свързаните с тях протеини той посвети повече от четвърт век. През 80-те години Косел проведе успешни експерименти по хидролиза на нуклеинови киселини и откри, че те съдържат аденин, гуанин, фосфорна киселина и още едно вещество, подобно на захар. Всъщност той откри първичната структура на тези най-сложни биополимери.

В клетката нуклеиновите киселини са тясно свързани с белтъчини, които имат основен характер. Косел отдели много сили и време за тяхното изучаване. Оказа се, че те са от групата на протамините (едни от най-простите белтъчини) и хистоните. Косел бе един от тези учени, които положиха основите на теорията за строежа на белтъчините като комплексни съединения, изградени от голям брой аминокиселини. Тези схващания бяха уточнени от Емил Фишер, който пръв успя да получи свързани помежду си аминокиселини и да покаже възможностите за подобен синтез.

Албрехт Косел се посвети на биохимията в един много важен за нея период, когато тя се утвърждаваше като наука. Изследвайки такива сложни съединения като нуклеиновите киселини и белтъчините, той откри редица от техните съставни елементи като хипоксантин, аденин, гуанин, които са съставна част на нуклеина, както и аминокиселината хистидин. За големите си успехи той получи Нобеловата награда по медицина и физиология за 1910 г. Тя му бе дадена за заслуги в развитието на клетъчната химия, направени чрез изследвания върху протеини и нуклеинови вещества.

През 1936 г. Макс Перуц, един млад австриец, попаднал при Джон Бернал в Кавендишката лаборатория, реши да разкрие структурата на хемоглобина с метода на рентгеновата дифракция. В групата на протеините тя е сравнително малка. От друга страна, това вещество пренася кислорода в кръвта и има огромно значение за физиологията. Първите рентгенограми бяха получени през 1937 г. Обектът на изследване бе конски хемоглобин. Резултатите бяха изключително трудни за интерпретация, тъй като по онова време нямаше компютри. Година след година Перуц продължаваше с огромно търпение експериментите си, подкрепян и насърчаван от У. Л. Браг, ръководителя на лабораторията. В 1953 г. Перуд успя да прикрепи към молекулата на хемоглобина на различни места атоми от живак. Това промени дифракционната картина и улесни нейното разчитане. В 1959 г., след повече от 20 години работа, Макс Перуц и неговите сътрудници можеха вече да покажат каква е триизмерната структура на хемоглобина. В тази работа му помагаха голям брой учени. Бернал го научи как да прави рентгенограми, а Д. Кейлин, един от големите английски биохимици на нашия век, му осигури достъп до своята биохимична лаборатория. Крик, Уотсън и Санджър, все бъдещи Нобелови лауреати, работеха при Перуц и усвояваха от своя страна неговото умение.

В 1946 г. кралските военновъздушни сили демобилизираха един специалист, участвувал в разработката на радарите. Джон Кендрю, завършил химия в Кембридж, се върна отново в този научен център и започна работа при Перуц. Той се заинтригува от структурата на протеините, под влияние на Бернал и Полинг, и реши да избере за свой обект една още по-малка белтъчна молекула. Той се спря на миоглобина. Това вещество е родствено на хемоглобина и се среща в мускулите. Неговата молекула е четири пъти по-малка и служи като резервоар на кислород. На миоглобина се дължи червеният цвят на мускулите. Той се среща особено много при морските бозайници, които остават дълго време под водата и имат нужда от голям запас на кислород в тъканите на тялото. Тяхната мускулатура е с много тъмен цвят поради голямото количество миоглобин.

Кендрю и неговите сътрудници извличаха миоглобин от месо на кашалот и също го обработваха с живак или злато, за да получат контрастни рентгенограми. Тази група изследваше по-проста структура и по-бързо постигна успех. В 1957 г. вече беше известна триизмерната структура на миоглобина.

В 1962 г. Нобеловите комитети по химия и по медицина и физиология решиха да наградят учени, постигнали успехи в разкриването на структурите на гигантските биомолекули. Наградата по медицина бе дадена на Крик, Уотсън и Уилкинс за определянето на структурата на ДНК. Лауреати на наградата по химия станаха Макс Перуц и Джон Кендрю, открили структурата на хемоглобина и миоглобина.

Общото за тези изследвания е, че бяха направени с метода на рентгеновата дифракция и с помощта на първите още несъвършени компютри. Сега на разположение на изследователите е много по-съвършена техника. Това дава възможност много по-бързо да се установява структурата на биомолекулите. В 1967 г. Д. Филипс разкри структурата на лизозима. Пак през 60-те години Стейн, Мур и Анфинсен разкриха строежа на рибонуклеазата и получиха за това Нобелова награда през 1972 г. Този процес е много бавен, но само чрез него може да се отиде от молекулните структури към молекулните комплекси и клетъчните субструктури и да се обясни строежът на живото вещество във връзка с неговата функция. Това е също една от големите задачи на бъдещето.

По-нататъшен прогрес в изследването на молекулните комплекси на клетката бе постигнат след работите на Аарон Клуг от лабораторията по молекулярна биология към Медицинския изследователски център в Кембридж. Той успя да съчетае рентгеновата дифракция с прецизна електронна микроскопия.

Клуг пристигна в Кембридж през 1949 г. и се научи да прави рентгенограми при Розалин Франклин, която даде решаващ принос за разкриването на структурата на ДНК. В началото той се насочи към изследване на вируса на тютюневата мозайка, търсейки да установи как нуклеиновата киселина се свързва с протеиновите молекули. Натрупаният опит се оказа много ценен впоследствие, когато Клуг се зае с човешките хромозоми. По-специално той се интересуваше от хроматина, както се наричат хромозомите, когато са в деспирализирано състояние между две клетъчни деления. Тогава те не се виждат в светлинен микроскоп и представляват тънки нуклеопротеидни нишки с диаметър 100–200 ангстрьома. По дължината на нишките са подредени елементарни субединици, наречени нуклеозоми, които представляват огънат участък на ДНК, съставен от нуклеотиди и белтъчни молекули от групата на хистоните. Всичко това много наподобява вирусите, с които вече се беше занимавал Клуг и благодарение на своя опит този изследовател успя да направи значителни открития.

Още от 1968 г. Клуг прилагаше рентгеноструктурен анализ в съчетание с компютри и математично обработване на данните. Впоследствие той усвои електронната микроскопия, стигайки до разделителна способност от 2,8 Å. Нека си припомним, че диаметърът на водородния атом е 1 Å. При това Клуг получаваше изображенията, без да използва контрастни вещества като атоми на тежки метали.

При такава разделителна способност вече се получават изображения на повечето атоми. Става възможно химикът директно да наблюдава молекулите и техните комплекси. Вероятно скритата мечта да се „види“ химичната реакция е вълнувала почти всеки изследовател, занимавал се с тази наука. Аарон Клуг, който плътно се приближи до тази цел, получи през 1982 година Нобеловата награда по химия. Неговите изследвания върху хроматина хвърлиха светлина върху най-фината структура на генетичния апарат. Това несъмнено ще ускори изследванията върху функцията на гените и в частност ще окаже решаващо значение върху разкриването на природата на рака и други заболявания. Гледайки към микросвета с тази нова техника, молекулярните биолози ще могат по-добре да разберат как работи клетъчната машина.