Валерий Чолаков
Нобеловите награди (51) (Учени и открития (1901–1982))

Генно инженерство

В началото на 50-те години известният вирусолог Салвадор Луриа се сблъска с интересно явление. Фаги, отгледани върху един бактериален щам, не се развиваха върху друг щам. Установи се, че тук не става въпрос за генетично различие между фагите. Оставаше да се изследва възможността, че бактериите ги приемат по различен начин. Несъмнено зад това стоеше някакъв ензимен процес, но неговата същност оставаше неясна до 1962 г., когато с този въпрос се зае Вернер Арбер от Биологичния център на Базелския университет.

Заедно със своите сътрудници той изследва и формулира принципите на т.нар. щамоспецифична рестрикция и модификация на ДНК. Оказа се, че при навлизането на вируса в бактерията той попада под въздействието на ензимния апарат, свързан с бактериалната ДНК (генния комплекс). Специални ензими атакуват вирусната ДНК и я разкъсват, като по този начин ограничават нейното размножение и функциониране. Това е същината на рестрикцията. По-нататъшните изследвания показаха, че рестриктивните ензими разпознават определени участъци от ДНК и се прикрепят към тях, за да разкъсат веригата.

Рестрикцията се оказа ефикасно средство за обезвреждане на бактериофагите. Тя обаче унищожава само определени разновидности. Някои фаги са се приспособили към определени щамове бактерии и заобикалят този механизъм, благодарение на което се размножават и съществуват. Арбер откри как може да се преодолее рестрикцията. Той установи, че в бактерията има и друг ензим, който модифицира химически определен участък от ДНК и прави невъзможно действието на рестриктивния ензим. Откритията на швейцарския учен бяха по принцип много важни, но все още далеч от практическо приложение. „Молекулните ножици“, открити от него, разкъсваха веригата на ДНК неспецифично и това не даваше възможност да се изолира определен участък. Ензимите се прикрепяха на едно място, а разкъсваха ДНК в друго.

След Арбер редица учени се насочиха към тази нова и вълнуваща област на молекулярната генетика и ензимология. Започнаха да се откриват подобни ензими в други микроорганизми. В 1970 г. Хамилтън Смит от университета „Джон Хопкинс“ в Балтимор направи щастливото откритие, че рестриктивният ензим на един микроорганизъм от друг вид разкъсва ДНК точно в мястото, в което се прикрепя. Този успех предизвика взрив на научна активност. Към 1975 г. от различни изследователски групи бяха изолирани вече 50 рестриктази, а днес те са стотици. Всички тези ензими разпознават и откъсват от ДНК участък, състоящ се от 4 до 6 двойки нуклеотиди. Големият брой рестриктивни ензими дава възможност ДНК да се прекъсва в най-различни точки и да се разделя на различни фрагменти, които съдържат определени гени. Освен за изолирането на гени те бяха използвани и за съставянето на генни карти. Такава работа бе извършена през 1971 г. от Даниел Натанс.

Този учен в продължение на много години изследваше един вирус по маймуните и с помощта на рестриктазите установи конкретно последователността на действие на различните гени, като най-накрая успя да разбере и подреждането на всичките 5 хиляди двойки нуклеотиди в двойната спирала на ДНК на вируса. Резултатите бяха постигнати с помощта на 14 рестриктази. За сравнение може да се каже, че ДНК на човека и другите висши животни имат по всяка вероятност над милион нуклеотиди.

Даниел Натанс стана през 1972 г. директор на отдела по микробиология на Медицинския факултет при университета „Джон Хопкиис“ в Балтимор, където Хамилтън Смит работеше като асистент. Заедно със своите сътрудници Натанс създаде ефикасен метод за изолиране в чист вид на фрагментите от ДНК с помощта на електрофореза. Така учените разполагаха вече с „молекулни ножици“, които да режат нужните фрагменти от ДНК, и с методи на изолиране на тези фрагменти. Оставаше да се намери „превозно средство“, което да вкарва изолираните гени в клетката.

Такива механизми всъщност бяха известни на учените отдавна. Още през 40-те и 50-те години, когато се полагаха основите на бактериалната генетика, бе открито явлението трансдукция — пренасяне на гени от една клетка в друга с помощта на вирус. Генът се прикрепва към вирусната ДНК, която впоследствие става част от бактериалната хромозома. Разбира се, този механизъм работи само при вирусите, които не унищожават веднага клетката. Другият механизъм е свързан с половия процес при бактериите. Клетките нормално си обменят генетичен материал с помощта на плазмиди — малки частици, съдържащи фрагменти от ДНК. Ако се вкара в плазмидите някакъв ген, те се превръщат в отлично превозно средство за неговото пренасяне вътре в бактерията.

Както всяка нова област на науката, създаването и развитието на генното инженерство бе резултат от дейността на голям брой учени и изследователски групи. Но винаги сред множеството могат да се открият хората е решаващите приноси. Вернер Арбер откри рестриктивните ензими. Хамилтън Смит намери първите рестриктази, откъсващи определени гени, а Даниел Натанс създаде метод за изолиране на гените и проведе цялостно изследване върху вирусен геном с помощта на тези ензими. Тези забележителни научни достижения направиха тримата изследователи лауреати на Нобеловата награда по медицина и физиология за 1978 г.

Сред основоположниците на генното инженерство е и Пол Бърг от Станфордския университет. В 1972 г., чрез химично въздействие, той успя да съедини ДНК на два вируса, получавайки молекулярен хибрид. Тази методика се оказа много ценна за присъединяването на различни гени към вируса с цел използването му като транспортно средство за проникване в клетката. Това даде интересната възможност за създаването на генни библиотеки. Гени, изолирани от най-различни организми, могат да се вкарват в бактериални клетки с помощта на фаги или плазмиди и да се размножават заедно с бактериите. Тези бактерии са фондът на генната библиотека и винаги при нужда от тях може да бъде изваден генът, който интересува изследователите за по-нататъшно проучване. Освен това гените, пренесени в необичайна среда, започват да действуват по друг начин и това дава възможност за изучаване на механизма на тяхната регулация.

Голям проблем за молекулярната биология е установяването на нуклеотидната последователност в ДНК. В тази област големи успехи постигна Фредерик Санджър, опитен експериментатор, който в средата на 50-те години разработи метод за определяне на аминокиселинната последователност на белтъчините и получи през 1958 г. Нобеловата награда по химия за разкриването на структурата на инсулина.

През 1965 г. в Кембридж, където винаги е работил, Санджър започна изследвания над структурата на нуклеиновите киселини и по-специално над първичната структура — нуклеотидната последователност. Бяха използвани белязани атоми, което даде възможност да се работи с нищожно количество материал от порядъка на микрограмове. Реакцията се състои в синтезирането на втора комплементарна верига, белязана с радиоактивен фосфор, върху матрица от еднонишкова ДНК. Тя се провежда в четири успоредни опита, в които на всеки нуклеотид се прекъсва нарастването на веригата. Получените фрагменти ДНК се разделят с електрофореза, което дава възможност точно да се определи дължината на крайния полинуклеотид. Във всяка от четирите проби реакцията спира съответно при аденин, гуанин, цитозин и тимин. Като се знаят фрагментите и броят на нуклеотидите в тях, може да се определи точното място на всяка от тези бази в молекулата на ДНК.

С този метод Санджър и неговите сътрудници се заеха през 1977 г. да определят положението на 16 500 нуклеотида в ДНК на човешки митохондрии. Тези клетъчни субчастици, които са енергийните станции на клетката, имат собствена ДНК и известна самостоятелност. Предполага се, че те, както и хлоропластите, са произлезли от симбионтни микроорганизми, които са се приспособили да живеят в клетката. Санджър и неговата група създадоха и други методи за изследване на нуклеинови киселини, с които в 1967 г. бе определена нуклеотидната последователност на един вид РНК, състояща се от 120 нуклеотида, а в 1977 г. върху две страници от сп. „Нейчър“ със ситен шрифт бяха изписани всичките 5375 нуклеотида на ДНК на фага ФХ 174.

В 1977 г. Уолтър Джилбърт от Харвардския университет създаде нов метод за определяне на мястото на нуклеотидите, базиращ се на разкъсването на ДНК по определен нуклеотид. Началото на този метод бе набелязано още в 1966 г. в съвместна статия на Джилбърт, неговия сътрудник Максем и съветския учен А. Д. Мирзабеков. Въобще съветските учени имат сериозен принос в тази методика. Мирзабеков, Колчински и Мелникова предложиха да се метилират аденинът и гуанинът и след това да се разкъсва ДНК чрез реакции с метилираните съединения. Джилбърт и Максем развиха метода и откриха индивидуални реакции, които прекъсват ДНК в мястото на всяка една от четирите бази. Получават се фрагменти, които също се изследват с електрофореза.

Предварителен етап при определянето на нуклеотидната последователност е разрязването на ДНК с помощта на рестриктази. Получават се фрагменти с по няколко хиляди нуклеотида, които са всъщност отделни гени. Така стъпка по стъпка се разкрива молекулярната структура на ДНК в бактерии, растения и животни. Някой ден ще бъде установена и нуклеотидната последователност в човешката ДНК, за чието записване ще са необходими вероятно няколко тома. Тогава ще може да се реализира идеята на Винер „да се предаде човекът по телеграфа“.

Съвременните научни изследвания са неизбежно колективни. Нобеловата награда обаче е индивидуална и затова лауреати могат да станат само главните участници, като тяхното награждаване символизира успеха на цялата група. Пол Бърг, Фредерик Санджър и Уилиам Джилбърт станаха Нобелови лауреати по химия през 1980 г. и това беше израз на признание за големите успехи на генното инженерство и молекулярната генетика.

В началото на 1981 г. вече бяха създадени автоматични апарати за изолиране на гени и за навързването им в различни вериги. Генното инженерство се съчета с микроелектрониката, подготвяйки чудесата на 21 век, когато човекът ще управлява живата материя така, както днес неживата. Дотам ще доведат съвременните опити по молекулярната рекомбинация на ДНК, която създава невиждани хибриди и най-неочаквани съчетания от гени.