Валерий Чолаков
Нобеловите награди (45) (Учени и открития (1901–1982))

Ензими

Една от основните прояви на живота е биокатализата. С това явление човекът се е сблъскал още в предисторически времена, когато по всяка вероятност е започнал да прави спиртни напитки. През 18 век Лавоазие изследва алкохолната ферментация и стигна до извода, че при нея захарта се разгражда на спирт и въглероден двуокис. Гей-Люсак проведе точен количествен анализ и установи, че теглото на захарта е равно на теглото на спирта и въглеродния двуокис, взети заедно. Това доказваше извода на Лавоазие. Причинителите на тези процеси бяха открити още в 1680 г. от Антони ван Льовенхук, който със своите микроскопи успя да види дрождите. Трябваше да минат обаче още 150 години, за да се развие клетъчната теория и да се стигне до извода, че ферментациите са дело на живите клетки.

През първата половина на 19 век бяха натрупани интересни факти за явлението катализа и в частност за биокатализата. В 1814 г. руският химик Константин Кирхоф откри в ечемичени зърна вещество, което разграждаше нишестето. Това бе ензимът амилаза. Той бе изолиран в 1833 г. от френските химици А. Пайен и Ж. Персо. По същото време Берцелиус предложи да се стриват живите клетки, за да се извличат от тях веществата, предизвикващи ферментация. Подобен експеримент направи Людерсдорф през 1846 г. в Берлин. Той стри върху стъкло клетки от дрожди и после ги добави към захарен сироп. Не се появи никаква ферментация.

Този и други опити бяха сериозен удар върху схващанията на Берцелиус, Либих и Вьолер, че биокатализата и ферментацията са обикновени химически процеси. По същото време други учени смятаха, че в живото вещество действуват особени закони, които не могат да се сведат до химичните. Разпространяваха се идеи за някаква тайнствена „жизнена сила“, която отличава живото от неживото. Тази идея беше много привлекателна в неясното положение, в което се намираше науката тогава. Завършък на тези схващания даде Пастьор в своите оригинални опити, които показваха, че ферментация е възможна само при наличието на живи клетки.

Големият френски учен беше безупречен в своите експерименти. Те обаче не отричаха възможността ферментите да действуват и извън живата клетка. Просто никой не беше успял да изолира в запазено състояние тези деликатни вещества. Такава задача си постави в 1893 г. Едуард Бухнер от Мюнхенската политехника. Със съдействието на Байер там бе създадена лаборатория за изследване на ензимите. Бухнер искаше да провежда експерименти по разрушаване на клетки, за да се извличат биокатализаторите. Ръководството обаче смяташе, че нищо няма да излезе от тези опити, правени още преди десетилетия, и наложи друга тема за работа.

Бухнер от своя страна потърси други университети. Той отиде в Кил, после в Тюбинген и накрая през лятната ваканция на 1896 г. успя да проведе своите експерименти в лабораторията на брат си Ханс, известен бактериолог от Хигиенния институт в Мюнхен. Бухнер смесваше дрождите с кварцов пясък и след разтърсване успяваше да разруши клетките. Той създаде метод за филтриране на фината хомогенна маса под голямо налягане. Така бе получен сок от дрожди с голяма ферментативна сила. В него нямаше нито частица живо вещество и въпреки това захарта се разграждаше.

Тези сполучливи опити, завършени през 1897 г., поставиха началото на съвременната ензимология. Едуард Бухнер получи през 1907 г. Нобеловата награда по химия за откриването на безклетъчната ферментация. След неговите изследвания сложните биокатализатори, наречени от известния биохимик Вили Кюне ензими, можеха да се изучават с методите на химията.

Опитите на Бухнер бяха разширени и модифицирани от Артър Хардън. В началото на века бе известно, че ензимите се инактивират при загряване. В 1906 г. Хардън и Йънг проведоха интересен експеримент. Към сок от дрожди те добавиха сок от варени дрожди. Ферментацията рязко се засили. Това наведе изследователите на мисълта, че ензимът се състои от две вещества, едното от които е термоустойчиво. Бухнер бе нарекъл открития от него ензим зимаза, от гръцкото име на дрождите. Хардън въведе понятието козимаза, с което обозначаваше устойчивия компонент на ензима.

Разработването на метода на ултрафилтрация през желатинов филтър даде нови възможности на изследователите. С негова помощ Хардън успя да раздели зимазата на съставните й части. През филтъра преминаваше само коензимът, който се оказа нискомолекулно вещество. Хардън установи, че в разлагането на захарта някаква роля играе фосфорната киселина, която се съединява с молекулите, образувайки глюкозодифосфат. Той бе уловил един елемент от биологичното разграждане на въглехидратите.

По-нататъшните изследвания са свързани с дейността на шведския учен от немски произход Ханс фон Ойлер-Хелпин. В 1906 г. той започна своите изследвания над ензимите заедно с Карл Мюрбек. След продължителни експерименти, прилагайки метода на Хардън за разделяне на ензим от коензим, те установиха, че козимазата е вещество от групата на нуклеотидите е молекулно тегло 490. Подробните изследвания показаха, че това е съединение на аденин с пентоза, което води до образуването на нуклеотид. Ойлер откри, че този коензим се среща и в много други биокатализатори с най-различни функции. Той даде тласък на изследването на коензимите. Те са сравнително прости вещества и разкриването на тяхната структура даде възможност да се изследват с методите на органичната химия метаболитните процеси, свързани с преноса на различни атоми.

Изследванията на Артър Хардън и Ханс фон Ойлер-Хелпин бяха свързани с много важен етап в развитието на ензимологията. Двамата учени — Ойлер от Стокхолмския университет и Хардън от Института Листър в Англия, станаха Нобелови лауреати по химия през 1929 г. за техните изследвания върху ферментацията на захарта и ферментативните ензими.

Още през миналия век редица учени се опитваха да отделят в чист вид веществата, предизвикващи биологичната катализа, за да могат да ги изследват. В 1896 г. Пекелхаринг изолира белтъчина от стомашен сок, но не успя убедително да докаже, че това е ензимът, който смила храната. Много усилия за извличането на ензими в чиста форма хвърли Вилщетер със своите сътрудници. Те не постигнаха никакъв успех и дори Вилщетер започна да развива теорията, че ензимите не са нито белтъчини, нито въглехидрати, а някакъв нов тип вещества с неизвестна структура. Тези мъгляви научни спекулации продължиха до 1926 г., когато Джеймс Съмнър от Корнелския университет успя да получи кристали от ензима уреаза и доказа, че това е протеин. Когато през 1917 г. той си постави тази задача, мнозина му се смееха, но това само го караше да преследва още по-неотстъпно целта си.

По думите на самия Съмнър, той просто имал късмет с избора на ензима. Вилщетер работеше със захараза и никога не успя дори да я концентрира. Съмнър избра растителни семена, в които в голямо количество се срещаше ензимът уреаза. След няколко години експерименти той успя да получи това вещество в кристална форма, като охлаждаше и центрофугираше хомогенат от растителни клетки. Този експериментален успех никак не е малък, особено като се има предвид, че самият Съмнър е изгубил лявата си ръка още на 17-годишна възраст, че лабораторията му бе бедна, а сътрудниците малобройни.

Отначало съобщението, че е кристализиран ензим, бе посрещнато с недоверие. Постепенно обаче броят на противниците намаляваше, докато накрая и последният — Рихард Вилщетер, прие резултатите. Веднъж след като бе направен пробив, с такива опити се заеха и други учени и скоро бяха постигнати нови резултати. Вторият биохимик, който успя да получи ензими в кристална форма, беше Джет Нортроп от Принстън.

Този изследовател работеше с храносмилателни сокове. Още в края на миналия век имаше указания, че това са белтъчни вещества. Пекелхаринг почти ги беше открил. В 1920 г. Нортроп повтори експериментите му и се задълбочи в тази насока, като 10 години по-късно успя да изолира от стомашен сок пепсин в чиста форма. Впоследствие той и сътрудниците му получиха още пет други ензима, усъвършенствувайки своята методика.

Това бяха забележителни открития в химията на ензимите и въобще на белтъчните молекули. Създадените методи за изолиране на тези сложни вещества, и то в кристална форма, бяха от изключително значение за техния анализ, особено с методите на рентгеновата дифракция. Връх на тези изследвания бе получаването на кристали от вируси, което направи Уендел Стенли в 1932 г. също в Принстън.

Вирусите бяха открити от руския учен Дмитрий Ивановски в 1892 г. Шест години по-късно холандецът Бейеринк ги изследва и пръв разбра, че това е някакъв нов тип причинители на заболявания с изключително малки размери и невидими в микроскоп. Откритието на Уендел Стенли, че те могат да кристализират, потвърждаваше белтъчната им природа и междинното положение между живия и неживия свят.

Резултатите на тримата учени получиха в 30-те години признание в цял свят. През 1946 г. те бяха удостоен ни с Нобеловата награда по химия. Половината бе дадена на Джеймс Съмнър за откритието, че ензимите кристализират, а другата половина бе разделена между Джон Нортроп за изолирането на ензими в чист вид и Уендел Стенли за получаването на кристали от вируси.

Изследванията върху коензимите показаха, че много от тях са нуклеотиди. Тези вещества са комплекс от три съединения, свързани помежду си — фосфорна киселина, захар (рибоза или дезоксирибоза) и една от т.нар. азотни бази (пръстеновидни съединения, които имат в състава си азот).

Когато английският учен Александър Тод се зае с нуклеотидите през 40-те години, техният състав беше в общи линии известен, но не беше ясно как се свързват помежду си различните субструктури. Едно откритие на Кон през 1949 г., даде указание за мястото върху петатомния пръстен на захарта, където се захващат другите съединения. Тод доразработи тези идеи и можа съвсем точно да определи структурата на нуклеотидите. Освен че беше изключително важен за ензимологията, този резултат даде възможност на Крик, Уотсън и други изследователи да работят над структурата на ДНК.

Александър Тод е известен и със своите изследвания върху витамините и редица други природни вещества с биологично значение. Той започна научната си кариера с опити върху растителните пигменти антоциани при Робинсън в началото на 30-те години. Най-известни са обаче изследванията му върху нуклеотидите и нуклеотид-коензимите, за което бе удостоен с Нобелова награда през 1957 г.

През 50-те години в Рокфелеровия университет в Ню Йорк работеха двама изследователи, чиито имена са неразделни за биохимиците. Това са Станфорд Мур и Уилиам Стейн. Те направиха големи открития в изследването на структурата на ензимите.

Биокатализаторите са белтъчни тела и тяхното изследване е част от химията на протеините. В тази област голям е приносът на Емил Фишер, който установи как се свързват аминокиселините, градивните частици на белтъчните молекули. Английският учен Фредерик Санджър създаде през 50-те години метод за определяне на аминокиселинната последователност в белтъчините. Така той определи структурата на хормона инсулин, за което получи Нобелова награда по химия през 1958 г. По същото време Мур и Стейн усъвършенствуваха метода, като създадоха автоматизиран апарат за изследване на полипептидните вериги, от които са изградени белтъчините.

Към 1960 г. двамата изследователи успяха да определят първичната структура, т.е. подреждането на аминокиселините в панкреатичната рибонуклеаза. Успоредно с това те усъвършенствуваха своята методика, доразвивайки метода на Санджър. Изследваните белтъчни молекули се разделяха на фрагменти с помощта на ензими. На биохимиците е добре известно, че различните ензими разкъсват молекулите в различни точки. Получаваше се набор от белтъчни фрагменти, които се изолират с йонообменни смоли и се анализират. Тези фрагменти частично се припокриват и това дава възможност при тяхното съпоставяне да се определи общата последователност на аминокиселините.

Стейн и Мур продължиха изследванията и върху други ензими, установявайки тяхната първична структура. Успоредно с тях работеше и Кристиан Анфинсен, който изучаваше връзката между първичната структура — подреждането на аминокиселините във вериги, и третичната структура — пространственото разположение на тези вериги. Тук трябва да се отбележи, че вторичната структура бе изследвана от Полинг в края на 40-те години. Той установи, че няколко полипептидни вериги се усукват, образувайки различни спирали. Спиралните нишки от своя страна също, се деформират по определен начин, изграждайки третичната структура.

Именно с този най-общ строеж на белтъчната молекула, който определя нейната форма и функция, се зае Кристиан Анфинсен от Националния институт по здравеопазването в Бетезда край Вашингтон. Неговите изследвания показаха, че при денатурация на белтъка, когато той се разпада на отделни полипептидни вериги, е възможно спонтанното възстановяване на пространствената структура. Разбира се, това става при положение, че самите вериги не са повредени. Тези резултати доведоха Анфинсен до извода, че първичната структура на белтъка съдържа цялата информация за пространствения строеж на молекулата. Това беше много важен извод за химиците. Той означаваше, че е достатъчно само да се подредят правилно аминокиселините във верига, за да се синтезира белтъчна молекула, която по нищо не се отличава от естествената.

Наред с тези теоретични приноси Анфинсен има големи успехи в усъвършенствуването на биохимичната методика. По-специално той модифицира метода на хроматографията на ензимите, като въведе т.нар. „афинна“ хроматография. При нея се използва сродството или, както се казва още, афинитетът на различните ензими, намиращи се в смесено състояние.

Изследванията на Стейн, Мур и Анфинсен оказаха голямо влияние върху развитието на химията на белтъчините и особено върху изследването на ензимите, които са сред най-интересните белтъчни молекули. Това ги направи Нобелови лауреати по химия през 1972 г. Те бяха наградени за фундаментални приноси в химията на ензимите.