Господин Свещаров
Разкази за съвременната биология (15)

Новите успехи на генното инженерство

Засега успехите на генното инженерство засягат само т.нар. рекомбинантни (хибридни) молекули, получени чрез хибридизация ин витро от ДНК-фрагменти с вирусен, бактериен и в много малка степен еукариотен произход. Първите стъпки на този нов клон на молекулната генетика бяха свързани с опитите за пренасяне на гени от бактерията ешерихия коли в човешки клетки с помощта на ламбдафаги и те завършиха неуспешно. Най-големите първоначални успехи на генното инженерство са свързани със създадените методи за „съшиване“ на генетични структури и по-специално на плазмиди. Твърде много опити бяха направени с бактерийния плазмид К, който пренася множествената антибиотикова устойчивост в бактериите. През 1973 г. бяха получени хибридни структури от два плазмида. Първата предава на бактериите устойчивост към тетрациклина, а втората — устойчивост към стрептомицина. Полученият по синтетичен начин хибриден плазмид може да прониква в бактерията ешерихия коли и да й придава устойчивост към двата вида антибиотици.

Създаването на такива комбинирани молекули стана възможно благодарение на използуването на специфичните ензими на бактерийните клетки, наречени ограничаващи (рестриктиращи) ензими, или рестриктази. За съществуването им се заговори в началото на 50-те години, когато известни микробиолози откриха ограниченото размножаване на фагите (рестрикция). Ето защо след откриването им тези ензими получиха сборното име рестриктази. Те са истински скрити в бактерийните клетки „ножички“, които бързо нарязват проникналата в клетките вирусна ДНК и по този начин им осигуряват своеобразен имунитет. В арсенала на съвременните генни инженери вече има повече от 50 вида рестриктази, като една от най-често употребяваните и досега остава рестриктазата от Е. коли. През 1978 г. на В. Арбер, Д. Натан и Х. Смит беше присъдена Нобелова награда по медицина за научноизследователската им дейност в областта на рестриктазите и тяхното използуване в генното инженерство.

Първият действително голям успех на генното инженерство беше постигнат през 1977 г. от групата на Г. Бойер от Калифорнийския университет. Изследователите успяха да „заставят“ бактерийните клетки от вида Е. коли да синтезират в себе си белтък, който нормално се произвежда само от специализирани жлези в организма на висшите животни. Става дума за соматостатина — хормон на растежа, който се синтезира в хипофизата. Известно беше, че той е изграден от 14 аминокиселинни остатъка. С помощта на генетичния код аминокиселинната последователност на хормона била преведена на „нуклеотиден“ език. След това по химичен път била синтезирана двойната спирала на ДНК, т.е. бил синтезиран изкуственият ген на соматостатина. Започнал най-отговорният момент в генетичната операция — присаждането на синтезирания ген в плазмида (пръстеновидната ДНК) на чревната бактерия Е. коли. Плазмидите били „разцепени“ на точно определени места в рестриктазите и там с помощта на други ензими свързали изкуствените гени. Получени били няколко варианта плазмиди, един от които след успешно размножаване започнал да синтезира соматостатин!

Разработеният метод е голямо постижение не само поради факта, че за пръв път бактерийни клетки са заставени да произвеждат животински белтък, но и защото дава възможност на промишлената микробиология да започне производството на този хормон в промишлени мащаби. На първо време евтиният соматостатин ще намери приложение в животновъдството за увеличаване продукцията от месо, мляко и вълна.

Към края на 1979 г. дойде съобщението, че със същия метод успешно е получен и хормонът на растежа при човека, който се нарича соматотропин. За разлика от животинския хормон на растежа човешкият е изграден от 191 аминокиселинни остатъка и дори на неспециалиста, вярваме, става ясно, че химичната синтеза на такъв полипептид е свързана с големи трудности и с още по-големи разходи. Медиците се надяват с бактериен соматотропин (който ще бъде много евтин!) в бъдеще да лекуват деца с нарушена дейност на хипофизната жлеза.

През 1978 г. екип от специалисти, работещи във фирмата „Джининтек инкорпорейтид“ в Сан Франциско, успя да „накара“ бактерията Е. коли да произвежда и друг много важен хормон — инсулина, който нормално се синтезира от задстомашната жлеза (панкреаса). Генетичната манипулация, която принудила бактериите да произвеждат инсулин, е подобна на описаната по-горе. Остава само да се изясни дали промишленото производство на бактериен инсулин ще бъде достатъчно рентабилно, за да се появи на пазара евтин и достъпен за всички болни от диабет препарат. Засега необходимият за болните инсулин се получава при преработване на панкреаси от едри преживни животни или от свине, но е много скъп и съдържа примеси, които предизвикват понякога тежки алергични реакции в пациентите.

През 1979 г. групата по генно инженерство, ръководена от Пол Брег, постигна голям успех в тази нова област на човешкото знание. Вече посочихме, че първата възможност на генното инженерство беше реализирана — бактериите бяха принудени да произвеждат евтино и в неограничени количества полезни за човека биологично активни вещества. Групата на Брег обаче работила върху другата перспектива на генното инженерство — лекуването на наследствени болести чрез внасяне отвън на здрав ген, който да замести неправилно функциониращия ген в човешките клетки. Експериментаторите успешно пренесли ген от топлокръвни животни — генът, кодиращ бетаверигата на заешкия хемоглобин — в клетките на друг топлокръвен организъм, сравнително близкородствен на човека — вид зеленоглава африканска маймуна. Следователно била осъществена трансгенозна манипулация от еукариотни в еукариотни клетки, докато доскоро говорехме само за трансгенози от еукариотни в прокариотни клетки. Освен успешното пренасяне на гени между два далекостоящи във видово отношение организъма било постигнато и функционирането на „трансплантираните“ гени. Доказателство за това било, че маймунските клетки започнали да синтезират заешки хемоглобин. За носител на глобиновия ген бил използуван вирусът CB–40. При нормални условия този вирус е инфекциозен и причинява тежки заболявания при маймуните. Екипът на Брег успял да замести с хемоглобиновия ген точно този участък в ДНК на вируса, който го прави болестотворен, без при това да се променят останалите му качества. По този начин в маймунските клетки била внесена нова информация, без да им се навреди по какъвто и да е начин. Веднага искаме да предупредим, че чрез тази генна манипулация сътрудниците на Брег съвсем не са искали да излекуват зеленоглавите африкански маймуни от дадена болест, нито пък чрез заешкия хемоглобин са повлияли на доброто настроение на пъргавите маймуни. Това е само един опит, който показва на другите изследователи начина, по който в бъдеще биха могли да се лекуват наследствените болести.

А сега нека разкажем по-подробно за работите на д-р Мартин Клайн от Калифорнийския университет в САЩ, за които специалистите твърдят, че са едно от най-големите постижения на 1980 г. в областта на генното инженерство. За тях именно споменавахме и в края на разказа за рака, защото, както ще видите по-нататък, тези изследвания дават нова и много голяма надежда в борбата срещу злокачественото израждане на клетките.

Най-голямата трудност при терапевтичното лекуване на туморите се състои в това, че противотуморните лекарства унищожават не само туморните, но и здравите клетки. Заслуга на Клайн е, че той за пръв път успя да проведе успешен опит, техниката на който в бъдеще може да подобри класическите методи за лекуване на туморите. Идеята за новото лекуване хрумнала на д-р Клайн при наблюдения над болни в клиниката. Той установил, че при лекуването им с метотрексат (силно действуващо противотуморно вещество) повишените дози от него не засилвали, а, напротив, отслабвали ефекта на лекуването. Този факт озадачил извънредно много д-р Клайн и той започнал да търси причините за получавания при лекуването обратен ефект.

Клайн знаел много добре, че метотрексатът блокира първото звено във веригата за синтеза на ензима дехидрофолатредуктаза (ДХФР), която се синтезира в клетките. В резултат на това рухва цяла верига от вътрешноклетъчната белтъчна синтеза и клетките загиват. Предполагало се също така, че туморните клетки се влияят много повече от действието на метотрексата и загиват по-рано от нормалните. Но защо клетките така успешно се противопоставяли на вкараните в организма увеличени дози от лекарството?

Отговор на този труден въпрос намерил друг американски изследовател — проф. Р. Шимке. Той размесил в епруветка зародишни клетки от мишка с метотрексат. Повечето от клетките загинали, но някои оцелели. Шимке отбрал резистентните клетки и им въздействувал с още по-големи дози от лекарството. Картината отново се повторила и така опитите продължили, докато най-после не била получена популация от клетки, напълно резистентни към метотрексата. Когато анализирали средата, в която живеела тази клетъчна популация, установили, че тя съдържа големи количества дехидрофолатредуктаза — ензим, който задействува производството на клетъчните белтъци, чието действие метотрексатът вероятно подтиска. За сравнение проф. Шимке използувал контролни култури, които били обработени със слаби дози метотрексат — те съдържали съвсем малки количества от въпросния ензим.

Шимке започнал да изследва хромозомите от клетъчните ядра. Както е известно, в тях се пазят плановете на всички белтъци, които задължително се синтезират в клетката. Върху една от тези хромозоми ученият открил гена, който отговаря за синтезата на ензима дехидрофолатредуктаза. Нещо повече — той установил, че този ген се различавал в зависимост от това, дали е взет от чувствителна или от резистентна към метотрексата клетка: в чувствителните клетки генът се съдържал в простата си форма, докато в резистентните той се повтарял няколко пъти. Или, казано с други думи, увеличената „батарея“ от гени в резистентните клетки можели да синтезират много по-големи количества от ензима ДХФР. Тези свои резултати проф. Шимке предоставил на д-р Клайн, който разказва следното за по-нататъшните си работи:

„Взех култура от клетки, чувствителни към метотрексат, и култура от клетки, резистентни към това лекарство. Сегмент от ДНК на тези клетки съдържаше гена, който отговаря за синтезата на ДХФР. В клетките от първия вид този ген е нормален, докато във втория вид клетки той е необикновено голям. След като отделно центрофугирах двете култури от клетки, получих два вида ДНК — едната със сегмент, който е съставен от нормалния ген, а другата със сегмент, изграден от гигантски ген. Във втория етап на опита използувах популация от лабораторни мишки, еднакви във всичко освен в кариотипа си — една от хромозомите на вида «T6» е по-дълга от хромозомите на вида «Са». Значението на тази подробност е в това, че позволяваше да се разграничават клетките.

От бедрената кост на мишката от вида «Са» извадих костен мозък. Същото направих с мишката от вида «T6». В среда, която съдържа калций, смесих клетките на костния мозък с предварително извлечената ДНК. Под действието на калция мембраната на клетките на костния мозък стана проницаема. ДНК навлезе в нея и се «закачи» за собствената ДНК на клетките. Включвайки чуждата ДНК, клетките на костния мозък включиха и чуждия ген, който бе присаден именно по този начин.

В третия етап от работата смесих обработените клетки и инжектирах сместа в коремната кухина на трета мишка от вида «Са», която предварително бях облъчил. Целта на облъчването е да се попречи на клетките на костния мозък да произвеждат кръвни клетки. Колкото и да беше странно и без да може да се обясни все още защо, обработените клетки отново заеха първоначалното си място — следвайки кръвния ток, те се настаниха в костния мозък и там броят им се увеличи. Наблюдавах ги именно в костния мозък на бедрената кост. Няколко дни по-късно те произведоха червени кръвни клетки. Очевидно тези кръвни клетки не можеха да произлизат от други освен от инжектираните клетки, тъй като собственият костен мозък на мишката не беше способен да ги произведе след облъчването на животното.

Накрая подложих мишката на постепенно увеличаващи се дози метотрексат и наблюдавах, какво става в костния й мозък. Клетките, които не произвеждаха червени кръвни клетки, бяха унищожени; загинаха и клетките, които съдържаха простия ген. Клетките с гигантския ген останаха резистентни и продължаваха да произвеждат червени кръвни клетки. Това беше и доказателството, че присаждането на гена е успешно.

Реших да присадя два гена едновременно — единият щеше да създаде резистентност към метотрексата, а другият щеше да произвежда нормален хемоглобин. Този вид двойно присаждане би могло да помогне при лекуването на болни от сърповидна анемия (при тази болест червените кръвни клетки имат формата на сърп поради това, че хемоглобинът им не е нормален). Когато се инжектира метотрексат, клетките на костния мозък на пациента ще бъдат унищожени и веднага заменени с клетки, подобни на клетките, които инжектирах на мишката. Тези клетки ще бъдат резистентни към метотрексата и ще произвеждат нормален хемоглобин“.

Фиг.20. Схема за трансгенозата на д-р Клайн.

Искаме да се извиним за малко дългото и вероятно отегчително описание на техниката около този наистина по брилянтен начин изпълнен опит, но изкушението да го предадем в подробности на читателите специалисти беше много голямо и то в последна сметка надделя. Освен това искаме да съобщим, че по повод на работите на Клайн френското списание „Сианс е ви“ цитира пасаж от издадената през 1975 г. книга на Салвадор Луриа — един от създателите на молекулната биология и носител на Нобелова награда за 1969 г. В нея световноизвестният учен изказва мисълта, че генното инженерство върви към етап, в който ще се стигне до „ремонт на място“ на увредени органи — черен дроб, сърце и дори нервна система. Това би могло според Луриа да става чрез автотрансплантиране на клетки, на които по лабораторен път, е присадена нормална ДНК вместо собствената им, която е увредена от генетичен дефект, злополука или вследствие на напреднала възраст. Според френското списание още на този етап може да се твърди, че използуваната от Клайн техника може би в най-скоро време ще даде ключа към подмладяването на индивида!

Няколко седмици след публикуването на работите на Клайн от Йелския университет в САЩ беше съобщено, че група специалисти по генно инженерство са успели да въведат чужди гени в генетичния комплекс на зародиши от мишки. Учените били уверени, че присадените от тях вирусни гени, които те инжектирали в току-що оплодени миши яйцеклетки, са се включили за постоянно в тъканите на развиващия се зародиш, като основно са изменили неговия генен състав.

Тези опити се смятат за значителен напредък в генното инженерство, защото позволяват да се измени наследствеността на живите същества чрез трансплантиране на специфични чужди гени. В по-далечно бъдеще това ще позволи да се създават животни, които притежават напълно нови за тях качества, а също така и да се открият нови пътища за лекуване на някои неизлечими досега наследствени болести у хората.

Мишите зародиши, в които бил имплантиран чужд генен материал, били убити веднага след раждането на малките. Следващият етап от работата на американските учени предвижда някои мишки с трансплантирани гени да изживеят целия си нормален живот (около 2 години), за да се наблюдава ефектът от действието на чуждия генетичен материал.

Малко преди предаването на книгата за печат дойде съобщението, че любимият обект на специалистите по генно инженерство — бактериите от вида ешерихия коли — чрез успешна трансгеноза са били „принудени“ да произвеждат още един полезен ензим — урокиназата, която играе много важна роля при разрушаване на образуващите се в кръвоносните съдове тромбове. До този момент за лечебни цели урокиназата се получаваше само от култивирани човешки клетки или се извличаше от урината. Засега урокиназата е първият човешки ензим и същевременно най-големият белтък, който се получава с методите на генното инженерство.

След като отново заговорихме за продуктивните възможности на бактериите ешерихия коли, не може да не съобщим и за успешните опити, проведени през 1980 г. от специалисти от Цюрихския университет и фирмата „Биоген“, които „накарали“ бактериите да произвеждат интерферон. Освен като антивирусно и антибактерийно средство в момента интерфероните се изпитват и като противотуморно вещество.

В заключение на нашия разказ за фантастичните постижения на генното инженерство искаме да дадем думата на доктора на биологичните науки проф. С. И. Алиханян. Той казва: „Днес развитието на генното инженерство обуслови решаването на редица фундаментални проблеми в биологията. Така при изучаване организацията на еукариотните гени беше направено сензационното откритие, че гените на животните се различават основно от гените на микроорганизмите. Ако в прокариотния ген последователността на нуклеотидите съответствува на последователността на аминокиселините в кодирания белтък, то вътре в структурните гени на еукариотите непременно има последователности, които не носят според сегашните понятия осмислена генетична информация и след транскрипцията се отстраняват от информационната РНК. Освен това се оказа, че в генома на животните присъствува нов клас гени — т.нар. мобилни гени, които могат да променят локализацията си в хромозомата. За пръв път с помощта на генното инженерство са изолирани и изучени гени, които са активни в определени стадии от диференцирането на клетките. Големи успехи са постигнати в дешифрирането на структурните гени, които кодират леките и тежките вериги на имуноглобулините, изучени са геномните преустройства, които водят до биосинтеза на антитела.

Голяма роля е призвано да изиграе генното инженерство и в промишлената микробиология, в конструирането на промишлени микроорганизми, способни да продуцират такива важни съединения, като ензими, аминокиселини, антибиотици, витамини, фуражни и хранителни белтъци, биологични средства за защита на растенията, пептидни хормони на животните и човека и др. С помощта на генното инженерство се решават и енергетични проблеми чрез създаването на щамове микроорганизми, които повишават ефективността от използуването на петролните кладенци. Не би трябвало да пропускаме и малко особено поставения въпрос за използуването на растителните организми в генноинженерните опити. Практическото приложение и перспективите за създаване на нови растения с помощта на генното инженерство изглеждат съвсем реални, тъй като вече са налице големи постижения по регенериране на цяло растение от изолирана клетка, изолирани са и успешно са размножени хаплоидни клетки от растения и са получени редица протопласти“.